反应釜导航
反应釜推荐
联系我们
电话:0571-86578098/81604278
联系人:张经理
网址:http://www.51fanyingfu.net/
E-MAIL: 2355663251@qq.com
办公地址: 杭州市临平迎宾路355号永安大厦1103 
当前位置: 网站首页 > 新闻动态 >

一株低温产纤维素酶细菌的筛选及其发酵产酶条件的优化

发布日期:2015-10-27 16:19:16作者:admin 点击次数:
摘 要:从不同土壤样品中分离得到一株低温产纤维素酶高活性的细菌,并对其液态发酵条件进行优化。结果表明,此菌株液体发酵培养基最佳配方为:蛋白胨 15.0g,羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10.0g,秸秆粉 10.0g,氯化钠 5.0g;最佳培养条件为:培养基 pH 为 6.0,发酵时间为 4d,发酵温度为 20℃,接种量为 4%,摇床转速为 180r/min;发酵条件优化后发酵液中纤维素酶活(CMCA)为 38.96U/mL,是优化前的 2.2 倍。
纤维素是地球上最丰富的可再生天然生物资源之一,同时也是一种非常重要的低成本生物质能源,对人类的可持续发展有着重要作用。我国纤维素资源相当丰富,每年可产生秸秆 7.0×1012kg,如何充分利用这一可再生资源,对缓解我国能源短缺以及解决环境污染问题有着重要意义。目前,秸秆纤维素的处理方法主要有物理法、 化学法和生物法。
物理法耗能高,化学法在浓酸浓碱处理后,带来新的环境问题, 生物法主要利用微生物产生纤维素酶进行降解。由于酶解法低耗能,反应条件温和无化学污染等优点而倍受青睐。而筛选纤 维 素 酶 活 高 的野生菌株,提高酶的活性,对秸秆纤维素资源化利用具有重要意义。过去产纤维素酶菌 株 的 筛 选 主要集中在中高温微生物, 对低温产纤维素酶的菌株报道相对较少,由于低温纤维素菌具有抗低温性,能在低温条件下快速生长、繁殖,能产生低温酶等优势,因而在工业生产、 生物修复和医药等方面有着潜在应用价值, 因此低温纤维素菌的筛选将成为高效纤维素菌株选育的主要方向之一。本研究从不同土壤样品中筛选出一株低温产纤维素酶细菌并对其液态发酵条件进行优化,以提高纤维素酶活性和产量,为低温纤维素酶的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 样品
样品采自沈阳市东陵区高坎镇玉米根际土和落叶表层土。
1.2 培养基
富集培养基:CMC-Na 2.0g,(NH4)2SO40.4g,K2HPO40.2g, MgSO4·7H2O 0.01g, 蛋白胨 0.1g,酵母膏 1.0g,蒸馏水 1000mL,pH 自然。
选择培养基:K2HPO40.5g,MgSO40.25g,CMC-Na2.0g,刚 果 红 0.15g,琼 脂 20.0g,蒸 馏 水 1000mL,pH自然。
液体发酵培养基:NaCl 5.0g, 蛋白胨 10.0g,CMC-Na 10.0g,蒸馏水 1000mL。
1.3 菌株筛选
分别准确称取 5.0g 样品加入到装有 50mL 富集培养基的 250mL 三角瓶中, 于 15℃、160r/min 培养24h,取 培养 液 稀 释 至 10-4、10-5、10-6, 采 用 涂 板 法15℃静置培养 48h 进行初筛。选择生长速度较快、水解圈较大的菌株进一步纯化, 并配合显微镜进行观察, 直到得到单菌落。 复筛采用液体发酵法,15℃、160r/min 培养 72h,测定 CMCA 酶活,筛选高活性菌株。
1.4 酶活测定
1.4.1 粗酶液制备
按 3%的接种量接入液体发酵培养基中,15℃、160r/min 培养 72h,取 30mL 发酵液于 4℃、5000r/min离心 15min,取上清液即为粗酶液。
1.4.2 酶活测定
纤维素酶活(CMCA)测定:在洁净干燥的试管中加入已预热的 CMC-Na 溶液 2.0mL,加入粗酶液 1.0mL,于 30℃水浴锅中保温30min,加入 3.0mL DNS 溶液终止酶促反应,充分摇匀,在沸水中加热 5min,取出后用流水冷却并定容至 25.0mL,于 540nm 测定其 OD 值,并计算纤维素酶活。1.0mL 粗酶液在 1min 内催化底物生成 1μg 葡萄糖所需酶量为 1 个酶活单位,用 U/mL 表示。上述过程以不接菌的培养液代替粗酶液作对照, 每组设置 3 个重复。
1.5 发酵产酶条件优化
1.5.1 培养基优化
对液体发酵培养基中的碳源、 氮源进行单因素试验,将液体发酵培养基中的碳源 CMC-Na 用秸秆粉、锯末、麸皮和微晶纤维素等量替换,培养 72h 按1.4.2 中的方法测定酶活;用酵母粉、牛肉膏和尿素等量替代液体发酵培养基中的氮源蛋白胨, 培养72h 按 1.4.2 中的方法测定酶活。通过单因素试验得到发酵产酶的最佳碳源和氮源,进行 L9(33)正交试验,选择产酶最高的培养基作为最优培养基。
1.5.2 培养条件优化
对培养条件中的 pH 值、发酵时间、发酵温度、接种量和摇床转速进行试验,测定不同条件下酶活,以确定最佳培养条件。

2 结果与分析
2.1 筛选结果
通过富集培养, 并利用选择培养基得到 YM、YM1、YM2、B、B1共 5 株能在低温条件下快速生长并能产生稳定水解圈的菌株, 分别接入液体发酵培养基中进行低温发酵产酶,测定各自纤维素酶活,结果表明 YM 酶活性最高,高达 17.63U/mL,故选择 YM为目的菌株。
2.2 培养基优化
2.2.1 最佳碳源确定
碳源是构成微生物细胞物质和代谢物的主要成分,同时还为微生物的生命活动提供能量。由于纤维素酶属于诱导酶,所以需要向培养基中添加纤维素,以诱导纤维素酶的合成。本实验选取一系列不同碳源作为唯一碳源进行发酵产酶,以确定最佳碳源。CMC-Na 和秸秆粉作为碳源时 CMCA酶活性较高,分别为 19.71U/mL 和 18.31U/mL,所以确定 CMC-Na 和秸秆粉为最佳碳源。而锯末、麸皮和微晶纤维素作为碳源时酶活相对较低, 可能是锯末中含有较高的木质素, 影响纤维素菌株对其的利用;麸皮加入到培养基中后,容易结块,培养基中氧气含量会受到影响,从而影响了菌株的产酶;微晶纤维素中结晶结构较为复杂,菌株不易利用,因而影响产酶效果。
2.2.2 最佳氮源确定
氮元素是构成生命大分子蛋白质和核酸的主要元素,同时氮源也是微生物的主要营养物质,对微生物的代谢有着重要作用。因此氮源对纤维素菌的发酵产酶也有着重要影响,选取不同氮源进行发酵产酶,其他条件不变的情况下,以确定最佳氮源。蛋白胨为最佳氮源,酶活达 18.89U/mL,其次为酵母粉、牛肉膏,尿素最差,酶活仅为 7.84U/mL。
2.2.3 多因素正交试验分析
对菌株发酵产酶的影响因素为秸秆粉>CMC-Na>蛋白胨,秸秆粉对产酶影响显著,最佳发酵培养基组合为 A2B2C3。 由此得出液体发酵培养基的最佳配方为 NaCl 5g, 蛋白胨 15g,CMC-Na10g,秸秆粉 10g,蒸馏水 1000mL。
2.3 培养条件优化
2.3.1 pH 对产酶的影响
有研究表明培养基 pH 对纤维素菌株发酵产酶的影响较大,所以本实验设置了 pH 从 4.0-8.5 不同的梯度培养基,研究 pH 对 YM 发酵产酶的影响。YM 产酶培养基 pH 范围较窄。pH 为4.0-6.0 时产酶逐渐升高,pH 为 6.0 时达到最大值,为 32.67U/mL, 当 pH 大于 6.0 时产酶急剧下降,pH为 8.5 时降至最低,可以确定 YM 产酶的最适 pH 为6.0。 出现此结果的原因可能与 YM 最适生长 pH有关,在偏酸性条件下更利于其生长和发酵产酶。
2.3.2 发酵时间对产酶的影响
测定菌株在不同培养时间的酶活, YM 产酶能力随着培养时间逐渐增强, 第 4d达到最高,为 34.27U/mL。YM 产酶持续时间较长,直到第 6d 后仍可达 26.68U/mL。但发酵后期由于培养基中营养物质的消耗、 代谢产物的积累以及菌株进入衰退期,菌株的产酶能力在 4d 后开始下降。
2.3.3 发酵温度对产酶的影响
选择发酵温度分别为 14℃,17℃,20℃,23℃和26℃进行发酵产酶。在 14-20℃之间,随着温度的升高菌株产酶能力逐渐增强;当温度达到20℃时,菌株 YM 产酶能力达到最高水平;当温度超过 20℃时,产酶能力开始减弱,这可能与菌株的生长温度有关。 由此可知菌株 YM 发酵产酶的最适温度为 20℃。YM 未来实际生产中可以节能减耗,具有较高的潜在经济和环保价值。
2.3.4 接种量对产酶的影响
向发酵产酶培养基中分别接种 3%,4%,5%,6%和 8%的种子液。接种量对产酶影响较大,最佳接种量为 4%;接种 3%时产酶最低,接种量大于 4%时产酶有所下降; 接种量在 5-8%之间时,产酶基本保持稳定。上述现象产生的原因可能是接种量过少造成菌体数量较少,纤维素酶产量相应较低;而接种量过大时,菌体数量过多造成营养不足,同时也限制了菌体的生长,产酶也样偏低。
2.3.5 摇床转速对产酶的影响
在摇床转速分别为 160r/min、180r/min、200r/min、220r/min 时进行发酵产酶实验。 180r/min时产酶最高,达 38.96U/mL,超过 180r/min 时产酶开始下降。 摇床转速主要影响菌与营养物质的粘附和溶氧量, 转速过高时可能对菌体造成一定程度的破坏,这些都可影响产酶效果。所以,确定最佳发酵摇床转速为 180r/min。

来源:惠合反应设备厂
顶一下
(0)
0%
踩一下
(0)
0%
------分隔线----------------------------